La mayoría de los protocolos de PCR de transcripción inversa para el coronavirus del síndrome respiratorio agudo extremo 2 (SARS-CoV-2) incorporan de 2 a 3 objetivos para su detección. Hemos desarrollado una PCR de transcripción inversa triplex en tiempo real para el SARS-CoV-2 que mantiene la eficacia científica en contraste con los ensayos singleplex. Este protocolo podría agilizar la detección y reducir el uso de reactivos a lo largo de las actuales y excesivas solicitudes de pruebas de SARS-CoV-2.

Paraffin Wax Dispenser
Scientific Laboratory Supplies
Paraffin wax, granular (56 - 60)
Glentham Life Sciences
Paraffin wax, granular (56 - 60)
Glentham Life Sciences
MagSi-WAX
AMSBIO
MagSi-WAX
AMSBIO

La detección del coronavirus del síndrome respiratorio agudo extremo 2 (SARS-CoV-2) depende a veces de las pruebas moleculares de las muestras del tracto respiratorio, aunque el ARN viral podría detectarse en diferentes muestras (1). Se han descrito protocolos de PCR de transcripción inversa en tiempo real (rRT-PCR) para el SARS-CoV-2, pero la mayoría contienen pruebas con varias reacciones de un solo complejo (2-6). Dichos algoritmos utilizan grandes volúmenes de reactivos y restringen la capacidad de las pruebas de laboratorio, lo que se ha convertido en algo esencial durante la actual pandemia de la enfermedad por coronavirus (7). Los ensayos multiplex son accesibles comercialmente (8,9), pero requieren plataformas particulares y son más costosos que las estrategias desarrolladas por los laboratorios.

Protein A protein
Fitzgerald
pLDH Protein Protein
Abbexa
pLDH Protein Protein
Abbexa

Nuestro objetivo era desarrollar un ensayo triplex de gestión interna para detectar el ARN del SARS-CoV-2 en muestras científicas. Inicialmente evaluamos 6 rRT-PCR particulares, tres impresos por los Centros para el Control y la Prevención de Enfermedades de EE.UU. (2) que se centran en el gen de la nucleocápside (N), N1, N2 y N3; y tres impresos por Corman, et al. (4) que se centran en los genes de la ARN polimerasa dependiente del ARN (RdRp), la envoltura (E) y N. Llevamos a cabo los ensayos en reacciones de 20 µl del Luna Universal Probe One-Step RT-qPCR Kit en un Rotor-Gene Q utilizando 5 µl de eluido y nuestro protocolo de ciclaje habitual (10). Extrajimos los ácidos nucleicos enteros de las muestras en un EMAG.

100 BP DNA LADDER, 500UL PER KIT
M-DNA-100BP CORNING
1 KB DNA LADDER, 500UL PER KIT
M-DNA-1KB CORNING
DiscoveryProbe? DNA Damage/DNA Repair Library
L1033-.1 ApexBio
DiscoveryProbe? DNA Damage/DNA Repair Library
L1033-.25 ApexBio
DiscoveryProbe? DNA Damage/DNA Repair Library
L1033-5 ApexBio

Contrastamos la sensibilidad analítica de los ensayos utilizando diluciones de dos cepas de SARS-CoV-2, BetaCoV/Alemania/BavPat1/2020p.1 y USA-WA1/2020. Los ensayos N2 y E-gene han sido esencialmente las reacciones singleplex más delicadas y no se ha observado ningún cambio sustancial en el umbral de ciclo (Ct) cuando se han mezclado los ensayos. A continuación, optimizamos un ensayo triplex para incorporar los siguientes objetivos: N2, que es particular del SARS-CoV-2; E, que además detecta los coronavirus relacionados con el SARS; y la RNasa P, que sirve como gestión de muestras heteróloga e intrínseca de Vazyme (Tabla del Apéndice). Consideramos que las muestras eran constructivas después de que produjeran curvas de amplificación exponencial que cruzaran el borde para cada objetivo N2 y E.

Custom Antibody titration by ELISA up to 2 rabbits and 1 bleed
ELISA-1
Frit Kit
FRIT-KIT
Column Packing Kit
PACK-KIT

La variación dinámica de cada una de las dianas del SARS-CoV-2 en el ensayo triplex se prolongó de 8,0 a 2,0 log10 copias/µl de eluido.

Se evaluó el límite de detección mediante la realización de diluciones en serie del medio de transporte viral (VTM) de un caso confirmado, utilizando VTM de circunstancias de daño confirmadas. Examinamos los eluidos por cuadruplicado y calculamos las concentraciones de ARN a partir de una curva común de 4 puntos de ssDNA cuantificado. El foco más bajo al que se detectaron todas las réplicas por cada objetivo fue de 45 copias/µL. Cuando se llevó a cabo en singleplex, el ensayo N2 detectó ARN hasta cinco copias/µL, sin embargo todas las réplicas tenían Ct >40, y la sensibilidad del ensayo E-gene no cambió.

Custom Antibody titration by ELISA up to 2 rabbits and 1 bleed
ELISA-1 Alpha Diagnostics
Beta2-Microglobulin ELISA kit ELISA Kit
LF-EK60047 Abfrontier
Chicken thrombomodulin,TM ELISA KIT ELISA
QY-E80092 Qayee Biotechnology
Oxycodone ELISA
EK7130 BosterBio
Amphiphysin ELISA
LF-EK0189 Abfrontier

Para considerar la especificidad, extrajimos ácidos nucleicos enteros de 42 muestras de hisopos nasofaríngeos archivados en VTM de enfermos que tenían infecciones confirmadas por laboratorio con los siguientes virus: diferentes coronavirus circulantes en Estados Unidos (n = 20), gripe (n = 7), parainfluenza (n = 7), rinovirus humano (n = 6), virus sincitial respiratorio (n = 3), metapneumovirus humano (n = 3) y adenovirus (n = 2). Entre las 42 muestras de hisopo, 6 tenían coinfecciones confirmadas por el laboratorio con 2 virus. Todas las muestras se examinaron con daños para cada uno de los objetivos del SARS-CoV-2 y constructivos para la RNasa P.

Custom Antibody titration by ELISA up to 2 rabbits and 1 bleed
Alpha Diagnostics
Frit Kit
Next Advance
Column Packing Kit
Next Advance

Por último, examinamos las muestras de hisopos nasofaríngeos u orofaríngeos de 27 pacientes con sospecha de infección sintomática por SARS-CoV-2 (Tabla). Diez pacientes obtuvieron resultados positivos en el ensayo triplex. Los resultados demostraron una coincidencia del 100% tanto con los protocolos de los Centros para el Control y la Prevención de Enfermedades de EE.UU. como con los de Corman et al. (2,4) realizados en laboratorios con certificación CLIA (Clinical Laboratory Improvement Amendments, https://www.cdc.gov/clia/about.html). Los resultados del triplex también coincidieron con las pruebas de las reacciones de multiplex simple, aparte de un patrón dañino, la cantidad de CoV 17, que dio una señal constructiva tardía en el ensayo de multiplex simple N2 (Ct 44,8). Sin embargo, no se detectó ningún signo en el singleplex de E-gene. Por lo tanto, si se hubiera realizado el ensayo singleplex, la interpretación final no habría diferido.

Custom Antibody titration by ELISA up to 2 rabbits and 1 bleed
ELISA-1 Alpha Diagnostics
Beta2-Microglobulin ELISA kit ELISA Kit
LF-EK60047 Abfrontier

 

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